胰岛素及其受体在肾缺血再灌注损伤中的作用

目的　探讨肾缺血再灌注 (IR)过程中胰岛素及其受体的作用。方法　采用钳夹肾动脉的方法建造急性缺血再灌注肾损伤模型。将大耳白兔分为对照组、单纯缺血再灌注组 (IR组 )、胰岛素处理组 (Ins+IR组 ) 3组 ,Ins+IR组再灌注的同时给予胰岛素溶液 (Ins3U/ kg.wt) ,而对照组和 IR组则给予等量生理盐水。测定各组动物的血糖、血清胰岛素水平及肾组织胰岛素受体高、低亲和力常数 (Kd1 ,Kd2 )和高、低亲和力受体最大结合容量(Bmax1 ,Bmax2 )。结果　缺血再灌注 2 h后 ,3组动物血糖值、血清胰岛素水平均较术前显著升高 (P<0 .0 5 ) ,IR组尤为显著 ,IR组 Kd1 、Kd2 、Bmax1 、Bmax2 均较对照组显著降低 (P<0 .0 5 ) ,Ins+IR组仅 Bmax2 较对照组显著降低 (P<0 .0 5 ) ;4 8h后 ,3组动物血糖值恢复至正常水平 ,对照组胰岛素水平恢复至正常水平 ,IR组也较 2 h时明显下降(P<0 .0 5 ) ,但仍明显高于对照组 (P<0 .0 5 ) ,3组动物 Kd1 、Bmax1 值无差异 ,Ins+IR组 Bmax2 仍维持较低水平 (P<0 .0 5 ) ,Ins组 Kd2 明显高于对照组 (P<0 .0 5 )。结论　在肾 IR过程中 ,内源性胰岛素的作用减弱 ,外源性胰岛素对肾组织高亲和力受体位点无下降调节作用 ,但胰岛素可引起低亲和力受体数目的下调。胰岛素减轻 IR肾损伤的作用主要是     

血清甘油三酯含量与HDL亚类组成的关系

目的：探讨血TG含量对HDL亚类组成及含量的影响。 方法： 采用双向电泳－免疫印迹检测法按血清TG含量分层，分析了106例TC正常及147例高TC受试者血清HDL亚类组成及含量。 结果： 无论TC正常或高TC人群，血清小颗粒的per-β1-HDL含量在TG边缘性高（TC正常人群除外）、高TG以及TG极高亚组显著高于相应TG正常组 (P＜0.05及P＜0.01），而且颗粒较小的HDL3b及HDL3a含量也有相似的变化，其中高TG人群HDL3b在TG极高组，HDL3a在TG升高的各亚组均显著高于TG正常亚组(P＜0.05及P＜0.01）；与此相反，大颗粒的HDL2b在高TG组和TG极高组显著少于相应的TG正常亚组（p＜0.05），HDL2a也在高TC人群的TG极高组显著少于TG正常亚组（P＜0.05）。此外，与TC正常的相应亚组比较，高TC人群的per-β1-HDL（TG边缘性高亚组）及HDL3b（TG极高亚组）显著高于TC正常人群的相应亚组（P＜0.05及P＜0.01）。 结论： 随着TG、TC水平的升高，血清HDL颗粒呈变小趋势；TG、TC含量变化是影响HDL亚类组成的重要因素。     

高密度脂蛋白亚类与蛋白激酶C活性的关系

目的：观察高密度脂蛋白（HDL）亚类与外周细胞和肝细胞HDL受体结合活性及细胞PKC活性的关系。方法： 以纯化的前β1-HDL及不含apoE的HDL3为配体，分别与人动脉平滑肌细胞（SMC）和肝癌细胞系HepG2反应，观察两种细胞HDL受体结合活性及细胞PKC活性的变化。结果： 前β1-HDL与SMC HDL受体的亲和力不仅显著高于不含apoE的HDL3与SMC HDL受体的亲和力（P＜0.05），而且还显著高于它与HepG2细胞HDL受体的亲和力（P＜0.05）；前β1-HDL和不含apoE的HDL3分别与SMC反应后，均可激活细胞PKC信号传递途径，且前β1-HDL的作用较不含apoE的HDL3更为明显；而这二种HDL亚类分别与HepG2细胞反应后，细胞PKC活性均无明显变化。结论： 前β1-HDL似乎可以比不含apoE的HDL3更为有效的促进细胞胆固醇移出，而且血浆中前β1-HDL可能更多地作用于外周细胞如SMC，并通过外周细胞膜上的HDL受体介导激活PKC信号传递途径，从而促进外周细胞中过剩的胆固醇移出，而肝细胞HDL受体介导的胆固醇进入细胞可能与PKC信号途径无关。     

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体，并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物，合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列，将其连接于克隆载体pMD18-T中；将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接，转化感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中，采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列，酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h），目的蛋白获得较高表达量，且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566，TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达，经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。     

microRNA启动子区甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响

目的研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs（miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a）表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响。方法不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR) 处理人肺癌细胞A549,分别作用24 h、48 h、72 h,采用CCK8法检测细胞增殖情况,计算增殖抑制率。20 μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞72 h,通过甲基化特异性PCR(MSP)检测A549细胞相关miRNAs启动子甲基化水平的变化;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测A549细胞相关miRNAs表达水平的变化。20 μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞0 h、24 h、48 h,采用划痕实验检测细胞迁移能力（计算细胞在24 h和48 h的划痕愈合率）;作用48 h,采用Transwell检测细胞侵袭能力。结果CCK8结果显示,随着5-Aza-CdR的处理浓度升高、时间延长,A549细胞的增殖抑制率逐渐增加。经5-Aza-CdR去甲基化处理后,MSP结果表明,实验组相对于对照组甲基化引物扩增条带减弱,而非甲基化引物扩增条带增强;Real-time PCR结果显示,相关miRNAs表达水平升高（P<0.05）。由划痕实验和Transwell检测结果揭示,经5-Aza-CdR处理后,A549细胞的生长愈合能力降低（P<0.05）,并且侵袭到Transwell小室滤膜下表面的细胞数亦减少（P<0.05）。结论人肺癌细胞A549经5-Aza-CdR去甲基化处理后,miRNAs表达水平升高,进一步抑制肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。     

载脂蛋白CⅢ基因多态性对不同体质量指数青少年血脂水平的影响

目的 探讨载脂蛋白CⅢ基因(APOC3) Sst Ⅰ和-482C＞T多态性与不同体质量指数(BMI)健康青少年血脂水平的相关性.方法 根据BMI将723例青少年按四分位数分为4组,从低到高依次为1组[BMI=(17.80±0.75) kg/m2,n=180]、2组[BMI=(19.39±0.32) kg/m2,n=182]、3组[BMI=(20.68±0.43) kg/m2,n=181]和4组[BMI=(23.40±2.05) kg/m2,n=180].抽取空腹静脉血5 mL,测定血脂,提取基因组DNA并采用PCR-RFLP法对APOC3 Sst Ⅰ和-482C＞T多态性位点进行分型.结果 随着BMI增加,身高和高密度脂蛋白胆固醇降低(P＜0.001);体质量、腰围、臀围、腰臀比、甘油三酯(TG)、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇升高(P＜0.001).SstⅠ多态性不同基因型青少年的血脂水平在1组、2组和3组中差异无统计学意义;在第4组中,血浆TG水平在不同基因型之间差异有统计学意义(P=0.022),S2等位基因携带者的TG水平高于S1S1基因型青少年.-482C＞T多态性不同基因型青少年的血脂水平在各组中差异无统计学意义.结论 在健康青少年中,APOC3 SstⅠ多态性S2等位基因对血浆TG的升高作用与BMI有关,降低体质量或可改善S2等位基因对血浆TG的增高作用.     

肥胖者高密度脂蛋白亚类组成与脂蛋白酯酶基因多态性的关系

目的探讨肥胖者高密度脂蛋白亚类组成与脂蛋白酯酶基因内含子8 HindⅢ酶切位点多态性的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片长多态性和双向电泳免疫印迹检测法,分析95例肥胖者和144例体质指数正常者的脂蛋白酯酶基因内含子8 HindⅢ多态性、高密度脂蛋白亚类组成及相对百分含量。结果肥胖组和对照组均以H H 基因型为主。肥胖组血浆甘油三酯、载脂蛋白B100、CⅡ、CⅢ、E、前β1高密度脂蛋白水平及甘油三酯/高密度脂蛋白胆固醇较对照组增加,而高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白AI、高密度脂蛋白2b水平及载脂蛋白E/CⅢ明显降低(P<0.05)。肥胖组H H 基因型者与H-H-者比较,血清甘油三酯、载脂蛋白B100、前β1-高密度脂蛋白、高密度脂蛋白3b含量显著升高,而载脂蛋白E/载脂蛋白CⅢ、高密度脂蛋白2a和高密度脂蛋白2b显著降低;肥胖组H H-基因型者与H-H-者比较,载脂蛋白B100、前β1高密度脂蛋白和高密度脂蛋白3b含量显著升高,而载脂蛋白E/CⅢ和高密度脂蛋白2a显著降低(P<0.05)。对照组H H 及H H-基因型者血清载脂蛋白CⅡ、载脂蛋白CⅢ和高密度脂蛋白3a含量均较H-H-者显著升高,而载脂蛋白E/载脂蛋白CⅢ、高密度脂蛋白2a、高密度脂蛋白2b显著降低(P<0.05)。结论脂蛋白酯酶基因H H 基因型与肥胖者增高的甘油三酯水平有关。中国人脂蛋白酯酶基因HindⅢ酶切位点多态性与高密度脂蛋白亚类的组成和分布相关,H 等位基因携带者高密度脂蛋白颗粒有变小的趋势,且肥胖者更为明显,表明H 等位基因携带者高密度脂蛋白成熟代谢障碍。     

高密度脂蛋白对HepG2细胞代谢综合征相关新基因MSRG表达的影响

目的:观察高密度脂蛋白对HepG2细胞代谢综合征相关新基因MSRG表达的影响。方法:实验于2006-03/10在四川大学华西基础医学与法医学院医学分子生物学省级重点开放实验室完成。设计MSRG引物及Taqman探针,构建标准质粒,建立RealtimePCR定量检测MSRG表达的方法。以含5%无脂蛋白血清的低糖DMEM培养基培养HepG2细胞,分别加入不同浓度的高密度脂蛋白(0,25,50,100,200mg/L)孵育24h;以含100mg/L高密度脂蛋白的5%LPDS低糖DMEM培养基孵育HepG2细胞不同时间(0,6,12,24,36h),分别以0mg/L及0h为对照,通过RealtimePCR检测MSRG的表达。结果:①不同浓度高密度脂蛋白孵育细胞时,在0～100mg/L范围,MSRG表达随高密度脂蛋白浓度的增加有下降趋势;与0mg/L组相比,MSRG在50,100mg/L组表达差异具有显著性意义(P<0.05);与100mg/L组相比,高密度脂蛋白200mg/L组基因表达有所回升,但差异无显著性意义(P>0.05)。②不同高密度脂蛋白孵育时间0～24h组,MSRG表达随时间延长有下降趋势;与0h相比,12,24,36h组基因表达降低(P<0.05),24h组MSRG表达最低;与24h组相比,MSRG在高密度脂蛋白孵育36h组表达有所回升,但差异无显著性意义(P>0.05)。结论:在低浓度(0～100mg/L)及短时间内(0～24h)高密度脂蛋白可以抑制HepG2细胞MSRG的表达。     

鼻咽癌患者IL-8和IFN-γ基因多态性的研究

目的 研究IL-8和IFN-γ基因多态性在鼻咽癌(NPC)患者中的频率分布,并分析其与NPC的相关性.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)分析105例NPC患者和109例健康对照者IL-8基因-251(A/T)位点的基因多态性;应用聚合酶链反应、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术检测两组人群中IFN-γ CA短串联重复序列多态性.分析两位点多态性与NPC的关系.结果 NPC组IL-8 -251(A/T)位点基因型、等位基因频率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);NPC组IFN-γ(CA)n 13等位基因频率低于对照组,差异具有统计学意义(χ2=5.878,P=0.015),其基因型(CA)13 /(CA)13 、(CA)13 /(CA)13-和(CA)13-/(CA)13-在两组人群中的分布也有差异(χ2=15.181,P=0.001). 结论在研究人群中未发现IL-8 -251(A/T)位点多态性与NPC相关;IFN-γ(CA)n 13等位基因与NPC具有相关性,提示IFN-γ重复序列基因多态性可能在决定鼻咽癌遗传易感性方面有一定意义.     

BDNF对H2O2诱导人肺癌细胞YTMLC-90凋亡的抑制效应

背景与目的:已证实在神经系统内外多种细胞中均可合成神经营养因子,如神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophic factor,BDNF)和神经营养素3/4(NT-3/4).这些神经营养因子不仅能促进神经细胞的存活、增殖和凋亡,也与癌细胞侵犯神经组织的活性有关;但BDNF与肺癌细胞的生物学行为是否相关尚未见报道.本文旨在研究BDNF对过氧化氢(H2O2)诱导人肺癌细胞YTMLC-90凋亡的作用.方法:用含人Ⅰ型胶原al链(COLIA1)基因启动子和增强子元件及在其3′端接BDNF cDNA的微基因pSVCEPBFCAT,转染人肺癌细胞YTMLC-90并驱动BDNF异位表达,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)显色法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色显微镜和电镜观察细胞形态及其超微结构的改变,琼脂糖凝胶电泳检测染色质DNA断裂.结果:经200 μmol/L H2O2作用24 h,转染pSVCEPBFCAT的YTMLC-90细胞生长抑制率为30.0%,而未转染YTMLC-90和转染空载体pSVCEPCAT的YTMLC-90细胞生长抑制率分别为84.60%和80.00%,实验组与两个对照组之间的差异均有显著性(P＜0.01);对照组YTMLC-90细胞可见凋亡特有的形态学及生物化学改变,如胞浆和核固缩、染色质断裂、DNA电泳呈梯状条带,而转染pSVCEPBFCAT的YTMLC-90细胞未发现上述凋亡特征.结论:BDNF促进YTMLC-90细胞增殖和拮抗H2O2诱导凋亡,抑制H2O2对人肺癌细胞YTMLC-90的细胞毒性.